바늘이

프로젝트 개요

기술개발 과제

국문 : 마이크로 니들 제작과 탐구

영문 : Microneedle Production and Exploration

과제 팀명

바늘이

지도교수

이종범 교수님

개발기간

2023년 9월 ~ 2023년 12월 (총 4개월)

구성원 소개

서울시립대학교 화학공학부·과 2017340004 김규근(팀장)

서울시립대학교 화학공학부·과 2017340019 설용훈

서울시립대학교 화학공학부·과 2019340019 문채린

서울시립대학교 생명공학부·과 2018560025 이희섭

서울시립대학교 환경공학부·과 2019890041 이서준

서론

개발 과제의 개요

개발 과제 요약

1. PDMS를 이용한 Microneedle mold 제작

2. PVA microneedle 제작

3. 전자현미경을 통한 PVA microneedle 제작

4. Microneedle의 성능 개선 방안 논의

개발 과제의 배경

Microneedle (MN)은 수십 개에서 수백 개의 마이크로미터 크기의 바늘을 사용하여 높은 피부 투과성을 가지고 고통없는 경피 투과를 가능하게 한다.

MN 패치 제조 방법은 크게 mold-free 방법과 micro-molding 방법으로 나뉜다. MN의 종류에는 solid microneedles, hollow microneedles, coated microneedles, swellable microneedles, and dissolving microneedles이 있다. 이 보고서에서 우리는 micro-molding 방법을 사용하여 Polyvinyl alcohol (PVA) based hydrogel을 사용하여 dissolving microneedle을 제작했다.

PVA는 FDA에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되며 높은 생체 적합성, 생분해성 및 약물 적재 능력을 가지고 있다. 고분자 PVA를 물에 녹여 사용하였으며, PVA 비율은 높을수록 그 물리적 특성이 강해지나 PVA 비율이 과도하게 높으면 PVA MN에서 기포가 잘 빠져나가지 않게 되어 기포를 제거하는데 과도한 시간이 필요해지거나 불량품이 만들어지게 될 수 있다. 20% 미만에서는 그 물성이 너무 약하고 그보다 위에서는 기포를 제거하기 힘들어 대개 20~25vol% 정도의 PVA 수용액이 사용되며 이번 실험에서는 20vol%의 PVA 수용액을 사용했다.

Polydimethylsiloxane (PDMS)은 저렴하고 광투과성이 뛰어나며 쉽게 제조할 수 있는 실리콘 기반의 고분자이다. Microneedle mold 제작을 위한 PDMS 혼합 비율을 결정하기 위해, 우리는 10:1, 10:2 및 10:3 (w/w, Sylgard A : Sylgard B, base : cross linker) 비율에 대한 tensile test 및 hardness test를 수행한 논문들을 조사했다.

논문 조사 결과, cross linker (경화제) 비율을 높이면 tensile strength가 감소하는 경향을 보였다. 또한, Young’s modulus 값은 10:1 및 10:2 혼합 비율에 대해 각각 E=1.527MPa 및 E=1.334MPa였다. 이러한 경향들은 Kim et. al. (2015) 연구와 관련이 있으며, 이 연구에 따르면 과도하게 cross linker를 혼합할 경우, PDMS가 덜 유연해진다고 말하며, 일반적으로 PDMS 합성에 사용되는 비율은 10:1 (w/w, base : cross linker)이라고 말한다.

또한, 10:1 비율의 PDMS에 대한 hardness average는 41.7±0.95 Shore A로 얻어졌으며, 10:2 비율의 PDMS의 hardness average는 43.2±1.03 Shore A로 얻어졌다. 이는 제조업체인 Dow Chemical Company에서 2017년 공표한 값인 44 Shore A와 근접한 값이다.

위와 같은 조사 내용을 바탕으로, 이번 프로젝트에서는 10:1 (w/w, base : cross linker) 비율의 PDMS를 사용했다.

개발 과제의 목표 및 내용

1. PDMS microneedle mold를 이용하여 PVA microneedle을 제작하고 전자현미경을 통해 그 형태를 관찰한다.

2. PVA microneedle에 Alexa 488 (염색약)을 포함한 DNA molecule을 주입하여 DNA molecule을 포함한 microneedle을 제작한다.

3. 형광현미경을 통해 주입한 DNA molecule이 PVA microneedle의 tip 부위에 주입되었는지 관찰한다.

4. Image J 프로그램을 이용하여 형광현미경으로 관찰한 사진을 합성한 후, Polymer base와 DNA molecule의 비율을 측정한다.

개발과제의 기대효과

기술적 기대효과

1. 센서를 통한 건강 모니터링 : 약물뿐만 아니라 센서를 MN을 통해 전달하므로써 병의 치료뿐만 아니라 병의 예방과 관리 및 추적까지 가능하게 한다.

2. Iot 기술과의 결합 : MN에 의한 체내 센서는 다양한 장치들과 연결되어 손쉽게 데이터를 교환하는, 새로운 방식의 일상생활을 가능하게 한다.

3. 후행 기술로의 영향 : 기술의 보편적 특성상 공통된 분야의 기술 간의 유기적 관계를 가지므로 약물전달로서의 MN은 차후 발전된 기술의 개발에 영향을 줄 것이다.

경제적, 사회적 기대 및 파급효과

1. 의료비용 절감 : MN을 통해 효과적으로 약물을 전달하게 된다면 병을 치료하기 위한 시간이 단축될 것이고, 의료비용 절감의 효과를 기대할 수 있다.

2. 의료의 접근성 향상 : 병원에 방문하기 힘든 지역에 사는 이들에게도 병의 치료가 가능해진다.

3. 생산의 활성화 : 새로운 기술의 활성화는 새로운 제조, 유통 산업의 활성화를 뜻하기도 하며 새로운 일자리를 창출하여 경제가 활성화될 것이다.

목표 달성을 위한 실험 방법

PDMS 제작 방법

1. Sylgard 184 A (polymer) : Sylgard 184 B (crosslinker) = 10 : 1의 질량비로 넣는다.

2. 작은 기포가 고르게 발생할 때까지 젓는다. (약 5분간)

3. 진공 펌프를 이용하여 기포를 제거한다.

4. Conical tube에 소분 후 냉동고에 보관한다.

Microneedle mold 제작 방법

1. PDMS 적정량을 dish 위에 붓는다.

2. 진공 펌프를 이용하여 기포를 제거한다. (약 20분간)

3. PDMS 위에 Master mold를 올린다.

4. 진공 펌프를 이용하여 기포를 제거한다. (약 20분간)

5. 70°C 오븐에서 경화시킨다. (약 20분간)

6. Tweezer를 이용해 master mold를 떼어낸다.

7. Dish에서 떼어낸 후, 면도날로 master mold 주위를 자른다.

Microneedle mold를 올린 Cornical tube 제작 방법

1. Cornical tube의 45ml까지 휴지를 눌러 담는다.

2. 그 위에 PDMS를 약간 붓고 70°C 오븐에서 경화시킨다. (약 20분간)

3. 그 위에 PDMS를 약간 붓고 (4-2)에서 제작한 Microneedle mold를 올린 후. 70°C 오븐에서 경화시킨다. (약 20분간)

PVA Microneedle 제작

1. (4-3)에서 만든 Microneedle mold 안에 pipette을 이용하여 PVA를 천천히 주입한다.

2. 진공 펌프를 이용하여 주입한 PVA의 기포를 제거한다. (약 10분간)

3. Centrifuge (300 RCF, 3 min, 25°C)를 이용하여 PVA가 Microneedle mold의 tip 부위로 충분히 들어가게 한다.

4. 위의 2, 3번 과정을 1회 반복한다.

5. 은박지에 구멍을 뚫고 Cornical tube의 뚜껑 대신 덮는다.

6. Incubator에서 경화시킨다. (약 1일 동안)

DNA molecule 준비

1. DNA molecule tube에 sonification과 vortexing 처리를 하여 DNA molecule을 미세화시킨다.

2. 소형 centrifuge를 이용하여 DNA molecule을 혼합 및 균일화시킨다.

DNA molecule 과 NFW(Nuclease free water)의 혼합

1. 이하 과정을 통해 DNA molecule과 NFW의 정량을 구한다.

- DNA molecule의 농도를 a ㎍/㎖ 라고 설정한다.

- 전체 부피를 200㎍/㎖, DNA molecule의 질량을 10㎍로 설정하여 수용액을 제조한다.

- 이때, 주입되는 DNA molecule의 부피는 10㎍/(a ㎍/㎖) = (10/a)㎖ = (10000/a)㎕ 이다.

- 따라서 주입하는 NFW의 부피는 200 - (10000/a)㎕ 이다.

- 활용하는 노란색 pipette은 소수점 첫째 자리까지만 표시되므로, 반올림한 후 소수점 첫째 자리 수준에서 NFW의 정량을 결정한다.

2. Tube에 NFW를 정량만큼 주입한다.

DNA molecule을 포함한 Microneedle 제작

1. (4-6)에서 제작한 혼합 용액에 sonification, vortexing, centrifuge 처리를 하여 용액을 균일화한다.

2. (4-3)에서 제작한 Microneedle mold에 DNA molecule 수용액을 주입한다.

3. 진공 펌프를 이용하여 진공 상태를 형성하고 1mbar 상태를 유지하며 DNA molecule 수용액을 증발시킨다. (약 30분간)

4. DNA molecule 수용액이 모두 증발할 때까지 3번 과정을 2~3회 반복한다.

5. Alexa 488 : PVA = 499 : 1의 비율로 혼합하여 염색약을 포함한 PVA 용액을 제작한다.

6. (4-4)의 PVA microneedle 제작 과정과 동일한 과정을 통해 DNA molecule을 포함한 microneedle을 제작한다.

광학 현미경 사용 방법

1. ISCapture 프로그램에 접속한다.

2. 흑백촬영 – DIC 모드로 설정한다.

3. Fluorescence mode에서 흰색을 선택한다.

4. Microneedle의 위치를 조절하며 휘어짐 혹은 뜯김이 없는 것을 선택하여 촬영한다.

형광 현미경 사용 방법 - Polymer base 관찰

1. 형광 촬영 – B로 돌린다. (이때 초점은 이동하지 않는다)

2. Fluorescence mode에서 초록색을 선택한다.

3. 조명을 킨다. (Exposure 값은 변경하지 않고, ms 값은 5로 설정한다)

형광 현미경 사용 방법 - DNA molecule 관찰

1. 형광 촬영 – B로 돌린다. (이때 초점은 이동하지 않는다)

2. Fluorescence mode에서 빨간색을 선택한다.

3. 조명을 킨다. (Exposure 값은 변경하지 않고, ms 값은 20으로 설정한다)

===MN 사진 합성 및 MN의 길이 측정(Image J 프로그램 이용)

1. Image J – win64 프로그램을 다운받는다.

2. 프로그램을 실행하여 팝업창을 띄운다.

3. 이미지를 드래그하여 팝업창에 놓아 이미지를 프로그램으로 불러온다.

4. Image – adjust로 들어가서 사진의 밝기와 명도를 비슷하게 조절한다.

5. Image – color – merge channels에 들어간다.

6. 붉은색 사진과 녹색 사진을 합성하는 경우, Red 항목에 붉은색 형광 사진을 선택하고 Green에는 녹색 형광 사진을 선택한다.

7. 붉은색 사진과 흑백 사진을 합성하는 경우, 흑백 사진의 image type을 8-bit에서 RGB로 변경한 후, Red 항목에는 붉은색 형광 사진을 선택하고, Gray 항목에는 흑백 사진을 선택한다.

8. 팝업창의 직선을 선택한 후 붉은색 사진과 녹색 사진을 합성한 사진에서 MN의 전체 길이와 DNA molecule이 tip 부위에 들어간 길이를 측정한다.

9. Scale bar 사진을 합성한다.

개발 과제 핵심 결과

MN의 형태학적 특성 : 500㎛ (10배율)

1. MN 전체 길이는 평균 446 µm, 표준편차 13 µm

2. 핵산 영역의 길이는 평균 175 µm, 표준편차 16 µm

3. 500 µm 몰드에 비해 약 50 µm 짧음

4. 핵산 영역은 MN 길이 중 30 ~ 48 % 차지

MN의 형태학적 특성 : 750㎛ (10배율)

1. MN 전체 길이는 평균 679 µm, 표준편차 15 µm

2. 핵산 영역의 길이는 평균 215 µm, 표준편차 30 µm

3. 750 µm 몰드에 비해 약 70 µm 짧음

4. 핵산 영역은 MN 길이 중 21 ~ 46 % 차지

MN의 형태학적 특성 : 1000㎛ (10배율)

1. MN 전체 길이는 평균 892 µm, 표준편차 26 µm

2. 핵산 영역의 길이는 평균 350 µm, 표준편차 32 µm

3. 1000 µm 몰드에 비해 약 110 µm 짧음

4. 핵산 영역은 MN 길이 중 30 ~ 48 % 차지

MN의 핵산 저장 능력

1. MN을 원뿔 모양으로 가정

2. MN의 핵산 영역 높이 (h1)와 전체 높이 (h2)의 비율의 세제곱을 통해 체적 비율 산정

3. 체적 비율 (%)을 'MN 핵산 저장 능력'으로 정의

4. 저장 능력의 표준편차는 3~4 %

5. 중앙에서 벗어날수록 핵산 유입이 적은 것으로 추정

원뿔형 MN과 피라미드형 MN의 비교

논문 조사 결과, stiffness, peak force, needle dissolution의 측면에서 피라미드형 MN이 원뿔형 MN보다 우수하다는 것을 확인했다. 이에 피라미드형 MN을 modeling하고 수학적 분석을 진행했다.

MN 옆면의 넓이가 증가하면 인체 내 조직과 접촉하는 면적이 증가하고, 따라서 약물의 전달속도가 증가할 것이다. MN길이 500㎛ 일 때는 값이 너무 튀어서 계산에서 제외하였다.

가정 1. 원뿔형 MN의 높이 = 피라미드형 MN의 높이

가정 2. 원뿔형 MN의 부피 = 피라미드형 MN의 부피

원뿔형 MN 밑면의 반지름 길이 = a, 피라미드형 MN 밑면의 한 변 길이 = x

1. MN길이 750㎛ 일 때, a= 78.8㎛, b = 750㎛

2. MN길이 1000㎛ 일 때, a= 91.38㎛, b = 1000㎛

따라서, 원뿔형 MN의 옆면 넓이 = , 피라미드형 MN의 옆면 넓이 =

위의 식에 각각의 a, b 값을 대입하여 계산한 결과는 다음과 같다.

1. MN의 길이 (b) = 750㎛

1) 원뿔형 MN 옆넓이: 186684µm²

2) 피라미드형 MN 옆넓이: 210356µm²

3) 피라미드형 MN의 옆면 넓이가 원뿔형 MN의 옆면 넓이보다 12.68% 넓다.

2. MN의 길이 (b) = 1000㎛

1) 원뿔형 MN 옆넓이: 288266µm²

2) 피라미드형 MN 옆넓이: 324910µm²

3) 피라미드형 MN의 옆면 넓이가 원뿔형 MN의 옆면 넓이보다 12.71% 넓다.

MN의 길이 (b)가 750㎛, 1000㎛ 일 때 모두 피라미드형 MN의 옆넓이가 원뿔형 MN의 옆넓이보다 약 12% 넓었다.

따라서 피라미드형 MN의 약물 전달속도가 원뿔형 MN의 약물 전달속도보다 빠를 것이다.

연구 결론

1. 핵산은 MN의 체적의 평균 4~6%를 차지하며 MN이 짧을수록 저장 능력이 좋음

2. 핵산 영역은 전체 길이 중 약 20~50% 차지

3. MN의 핵산 저장량은 1000μm : 750μm : 500μm = 96 : 27 : 2로, 길이가 길수록 핵산 저장량이 많음

4. 피라미드형 MN 적용 시 약물전달이 더 빠를 것

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