이종범교수님 1팀
2019 CE
프로젝트 개요
기술개발 과제
국문 : si-RNA의 임상 동향과 특허 분석
영문 : Clinical Trends and Patent Analysis of si-RNA
과제 팀명
이종범1팀
지도교수
이종범 교수님
개발기간
2023년 9월 ~ 2023년 12월 (총 4개월)
구성원 소개
서울시립대학교 화학공학과 2017340027 윤서현 (팀장)
서울시립대학교 화학공학과 2017340012 김형민
서울시립대학교 화학공학과 2017340020 성강현
서울시립대학교 화학공학과 2017340040 장준호
서론
개발 과제의 개요
개발 과제 요약
◇ si-RNA를 이용한 치료제의 동향을 파악한다. ◇ si-RNA 전달의 개선 방안에 대해 연구한다. ◇ 출원된 si-RNA 치료제의 특허에 대해 분석한다.
개발 과제의 배경
◇ RNA 간섭을 일으켜 특정 단백질의 발현을 막아 질병을 치료가 가능하다. ◇ RNA 간섭을 일으키는 물질로는 si-RNA와 mi-RNA가 존재하고 그 중 si-RNA로 치료제를 제조한다. ◇ si-RNA 치료제 임상 동향을 파악하여 실제 효과와 상용화 가능 여부를 파악 가능한다. ◇ si-RNA 특허를 분석하며 개발 방향성 파악과 개선방안에 대해서 연구한다.
개발 과제의 목표 및 내용
◇ si-RNA는 dsRNA가 dicer에 의해 잘린 조각을 뜻한다. si-RNA는 다음과 같은 메커니즘에 의해 작용한다. siRNA가 세포 내로 들어가면 argonaute를 포함한 단백질 복합체와 결합하게 되고, 다른 효소에 의해 guide strand만 남긴 채 RISC라는 복합체를 완성하게 된다. 이 RISC가 mRNA를 인식하여 상보적인 결합을 하게 되고, 이로 인해 mRNA가 절단되면서 단백질 합성을 막게 된다. ◇ si-RNA는 mi-RNA에 비해 안정성이 상대적이 높고, target RNA와의 상보적인 결합으로 인해 off-target 효과가 적다는 장점이 있다. ◇ si-RNA에서 해결되어야 하는 문제점들은 다음과 같다. RNA는 혈청 내의 exo- & endo-nucleases에 의한 가수분해에 취약하고, 크기가 작아 신장에 의해 쉽게 제거되어 반감기가 짧다. 또한 si-RNA 내의 polyanions으로 인해 세포 흡수율이 낮다. 그리고 다른 내인성 질환 유전자 조절 과정에 의도치 않은 영향(off-target effect)을 줄 수 있다.
관련 기술의 현황
관련 기술의 현황 및 분석(State of art)
- 전 세계적인 기술현황
◇ siRNA modification: siRNA의 가수 분해를 방지하고, 인체 내에서 siRNA에 대한 면역반응을 감소시키고, Base간의 결합 안정화하기 위해 siRNA의 ribose, phosphonate, base부분에 modification을 한다.
-phosphonate modification: 소수성 치환기를 이용하여 가수분해를 방지한다.
•phosphonate의 nonbridging 산소를 소수성 치환기로 치환한다.
•주로 phosphorothioate(PS), boranophosphate(BP) 등을 사용한다.
-ribose modification: 소수성 치환기 또는 친전자체 치환기를 2'-OH기 대신 사용하여 가수분해효소에 의한 가수분해를 방지한다.
•대표적으로 2′-O-methyl (2′-OMe), 2′-O-methoxyethyl, 2′-fluoro(2′-F), 2′-O-benzyl 등이 있다.
•2'-C, 4'-C와 sugar ring도 변형을 겪을 수 있습니다.
-base modification: 열역학적 안정성과 염기 간의 수소결합을 강화하기 위해 사용한다다.
•현재 대표적인 base modification 적용 물질로는 5-Br-Ura and 5-I-Ura이 있다.
-modification patterns used in clinical studies or for commercial siRNA
•siRNA는 19~21개의 염기길이를 가집니다. 모든 monomer를 같은 치환기로 modification하면 독
성이 생기거나 siRNA activity가 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
•적절한 modification 전략을 통해 siRNA 안정성과 생체적합성을 향상시켜 위와 같은 문제를 해결
할 수 있다.
◇ siRNA delivery&drug development
-barriers to siRMNA delivery
•유전자 침묵을 달성하기 위해 투여된 siRNA는 일련의 장벽들을 피할 필요가 있다. 이를 위해 siRNA를 포장하는 방법을 사용한다.
•대표적인 방법으로 미셀구조를 사용한 Lipid nanoparticles(LNPs), dynamic polyconjugates(DPC™), Ligand conjugates 등이 있다.
-naked siRNA-based therapeutics
•siRNA의 연관된 전달 시스템을 포함하지 않는 시스템이다.
•delivery 시스템에 의한 보호 효과가 제공되지 않기 때문에 siRNA는 효소의 분해에 저항력이 있고
혈류에서 순환 시간을 연장할 수 있도록 modification되어야 한다.
-Micelle structure & Lipid and Lipidoid-based nanoparticles(LNP)
•siRNA의 인체 내 보호를 위해 Micelle 구조와 LNP를 사용해 siRNA를 포장하는 방법이다.
•양전하를 띄기 때문에 세포 내 흡수를 용이하게 한다.
- delivery platforms
•Arrowhead에 의해 개발된 전달 시스템입니다.
•1세대 DPC 기술은 siRNA에 가역적으로 부착되는 고분자 backbone과 차폐제(PEG) 및 2관능 말레
아마이트 연결에 의한 표적 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법입니다.
•2세대 DPC 기술에서 siRNA는 폴리펩티드와 결합되는 대신 콜레스테롤과 함께 변형됩니다.
-Ligand conjugates
•특정 수용체의 리간드를 siRNA에 사용하여 수용체와 리간드의 상호작용을 통해 off-target 효과를
감소하는 방법이다.
•대표적으로 간세포를 targeting 하는 GalNAc conjugate가 있다.
*특허조사 및 특허 전략 분석
◇ RNA 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
출원번호 : 10-2010-019403
특허권자 : 성균관대학교산학협력단
발명자 : 이동기, 푸자 듀아
본 발명은 신규한 siRNA 구조 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안티센스 및 센스로 구성되는 이중가닥의 siRNA 분자로서 상기 siRNA의 안티센스 상에, 특히 5' 말단의 2번째 위치에, 단일 뉴클레오티드의 도입에 의한 단일 뉴클레오티드 벌지(bulge)를 적어도 하나 이상 가지는 것을 특징으로 하는 siRNA 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 siRNA 분자는 우수한 목적 유전자 발현 억제 효율을 보이면서도, 안티센스 가닥에 의한 오프-타겟 효과를 최소화한 타겟 선별성이 향상된 새로운 구조의 siRNA 분자를 제공함으로써, 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 유전자 치료 등 siRNA를 기반으로 하는 유전자 발현 억제 기법에 널리 사용될 수 있다.
◇ RNA 간섭을 유도하는 핵산 분자 및 그 용도
출원번호 : 10-2011-0090665
특허권자 : 성균관대학교산학협력단
발명자 : 이동기
본 발명은 신규 구조의 RNAi를 유도하는 핵산 분자 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목적 핵산 (target nucleic acid)과 상보적인 일부 영역을 포함하는 24~121nt 길이의 제1가닥과, 상기 제1가닥의 목적 핵산과 상보적인 일부 영역과 상보적 결합을 형성하는 영역을 갖는 13~21nt 길이의 제2가닥으로 구성되는 구조를 갖도록 하여 목적 유전자의 발현 억제 효율을 증가시킨 새로운 구조의 핵산 분자 및 이를 이용한 목적 유전자의 발현 억제 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 핵산 분자 구조는 유전자 억제 효율을 증가시키거나, 또는 antisense DNA, antisense RNA, ribozyme, DNAzyme의 도입에 의해 siRNA와 함께 동일 목적유전자에 대한 결합력 향상 또는 synergistic cleavage가 일어나는 효과가 있어 목적 유전자 억제 효율을 증가시킬 수 있다. 아울러, 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용함으로써 유전자 억제 효율의 지속기간을 연장시킬 수 있다. 이에 본 발명에 따른 RNAi를 유도하는 핵산 분자는 종래의 siRNA 분자들을 대체하여 siRNA를 이용한 암이나 바이러스 감염 치료 등에 활용될 수 있어 유용하다.
특허전략은 다음과 같다
◇ siRNA modification을 통해 기존 siRNA 대비 목적 유전자의 발현 억제 효율을 증가시키고, 낮은 농도의 투여량에도 치료 효과를 보일 수 있도록 한다.
◇ siRNA delivery system을 바꾸어 생체 내 안정성을 높이고, 타겟 기관으로의 전달력을 높인다.
◇ 현재까지 특허가 출원된 질병 외에 siRNA로 치료 가능한 질병에 대해 조사한다.
개발과제의 기대효과
기술적 기대효과
◇ siRNA를 사용하여 실질적으로 질병의 원인이 되는 유전자의 발현을 억제한다. ◇ mRNA의 서열 특이적인 유전자를 억제시키는 siRNA를 표적세포에 전달 시켜 다양한 질환에 적용가능하게 된다. ◇ 생체 내 불안정성, 전달의 비효율성, 비 특이적 작용으로 인한 치료효과의 저해를 해결한다.
경제적, 사회적 기대 및 파급효과
◇ 종양치료, 심혈관계, 퇴행성 뇌질환, 안과 질환, 대사 질환, 바이러스 감염과 같은 질병에 부작용을 최소화 하면서 치료한다. ◇ 기존의 약물 치료가 어려웠던 질병에 대해 제약 없이 모든 인간의 유전자 특이적인 공략이 가능한 치료제로 사용이 가능하다. ◇ 치료제가 없는 난치질환에 해결책이 될 수 있다.
기술개발 일정 및 추진체계
개발 일정
단계별 세부개발 내용 담당자 개발기간 (월단위) si-RNA 치료제의 원리 파악 김형민 9월 si-RNA 치료제의 특허 분석 성강현 9~11월 si-RNA 치료제의 임상 동향 파악 전원 9~11월 si-RNA 치료제의 개발방향성 파악 윤서현 11~12월 si-RNA 치료제의 개선방안 연구 장준호 11~12월
구성원 및 추진체계
◇ 김형민 - si-RNA 치료제의 원리 파악 ◇ 성강현 - si-RNA 치료제의 특허 분석 ◇ 윤서현 - si-RNA 치료제의 개발방향성 파악 ◇ 장준호 - si-RNA 치료제의 개선방안 연구 ◇ 구성원 전원 - 연구 취합 및 발전 방향성 제시 및 고찰
개념설계안
◇ modification을 통해 가수분해 방지를 하고, 면역원성을 높이고, base 간의 결합을 안정하게 만들어 치료제 성능을 개선하고자 한다. 또한 delivery를 사용하여 off-target effect를 감소시키고, 세포내 흡수를 용이하게 한다. ◇ chemical modification에는 크게 ribose, phosphate linkage, base modification로 나뉜다. ribose modification은 주로 ribose의 2‘ 위치에서 일어나고 RNA의 3’ overhang과 5‘ overhang에서는 ribose의 4’ 위치에서도 일어난다. 해당 위치에 주로 bulk한 소수성 치환기를 달거나 친전자체를 달아 핵산분해효소에 의한 가수분해를 방지한다. 그리고 phosphate linkage modification은 RNA를 연결하는 인산 부분에서 일어나는 modification이다. 기본적으로 소수성 치환기를 달고, 양이온이나 중성원자가 사용될 경우 세포 내 흡수가 증가한다는 장점이 존재한다. 마지막으로 base modification은 RNA의 염기에 modification을 하는 것이다. 열역학적 안정성이 증가하고, 수소결합을 강화한다. modification은 중복 하여 적용 가능하다.
◇ siRNA의 염기 길이는 19~21이다. 동일한 modification을 모든 monomer에 적용할 경우 독성이 나타나거나, 활성도가 감소하는 경우가 존재한다. 이를 방지하기 위해 각각의 modification의 특성을 고려하여, 각 monomer마다 다른 modification을 적용하여 siRNA를 제조한다.
◇ delivery에는 , Ligand, Micelle 기술 등이 있다. 기술은 polymer backbone을 통해 여러 구성 요소를 추가하여 안정적으로 운반하는 기술이다. 즉, polymer backbone에 si-RNA, shielding agent, targeting ligand 등을 달아 세포 내로 손실 없이 흡수될 수 있도록 설계한 구조체이다. Ligand 기술은 리간드가 목표 세포의 수용체와 결합하여, si-RNA가 효과적으로 세포를 targeting할 수 있도록 하는 기술이다. 마지막으로 Micelle 기술은 micelle로 둘러싸인 구형 구조 내부에 si-RNA을 넣어, si-RNA를 보호하는 방법이다.
상세설계 내용
◇ Micelle+ligand, DPC, ligand, micelle, control 순으로 gene expression이 작은 것을 확인할 수 있다. 즉 micelle+ligand가 가장 gene silencing이 뚜렷한 것을 확인할 수 있고, 따라서 두 개의 delivery 기술을 중첩한 것이 효능이 제일 좋은 것을 알 수 있다.
◇ Boranonophosphate는 사용할 경우, 가수분해 저항성 증가에 도움을 주고, 활성도 증가에 영향이 없어 사용하였다. 2‘F는 전체 염기개수에서 25% 이상을 차지하면 독성이 증가하는 문제점이 있으므로, 전체 21개 중 4개에만 사용하였다. 2’ O-MOE는 전체에 사용할 경우 너무 bulk하여 안정성이 감소하지만, 일부에 사용할 경우 endo-nuclease에 높은 저항성을 띠므로 사용하였다. 2‘ O-Me는 전체에 사용할 경우 si-RNA의 활성도가 낮아지는 문제가 발생하므로, 다른 친전자체로 modification된 형태를 사용하였다.
결과 및 평가
완료작품의 평가
평가항목 평가방법 적용기준 개발목표치 비중(%) 결과
기술성 해당 기술이 현재 기준 제일 개선된 기술인지 발행연도 2년 이내 25 O
경쟁성 해당 기술이 상대적으로 우위인 이유가 있는지 임상성공률 5% 25 0
적합성 해당 기술이 여러 질병에 적용하기 적합한지 치료가능 유전병 및 25 O
질병 종류 희귀병 타겟
효능성 해당 기술이 충분한 효능을 가지고 있는지 치료 성공률50% 이상 25 △
향후계획
◇ 향후 si-RNA 기술을 통해 유전병 및 희귀병 치료율이 높아지고, 치료에 드는 비용도 감소할 것으로 기대된다. 또한, 암 치료 과정에서 targeting 성능을 높여 암세포만 효과적으로 제거하여, 치료 중 환자의 건강 저하를 막을 수 있을 것이다. ◇ si-RNA의 흡수율을 높여, 신장에서 약물이 쌓이는 것을 방지해 side-effect를 줄일 수 있을 것이다. 이로 인해 si-RNA의 복용량을 기존보다 줄일 수 있으므로, 치료 기간 및 치료비용을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
